體視顯微鏡樣品制備五步法：從固定到成像的全流程解析

作為宏觀觀察利器，體視顯微鏡以立體成像、大景深、寬視野著稱，廣泛應(yīng)用于質(zhì)檢、生物解剖、工業(yè)檢測(cè)等領(lǐng)域。其樣品制備雖不如電子顯微鏡復(fù)雜，但仍有五大關(guān)鍵步驟直接影響成像效果。本文基于Leica、Olympus等設(shè)備使用規(guī)范，系統(tǒng)梳理從樣品固定到三維合成的全流程。

一、樣品固定：穩(wěn)定性與可視化的平衡術(shù)

固定方式選擇

微型樣品：導(dǎo)電膠粘貼法（銀膠/碳膠）

脆弱樣品：瓊脂糖包埋法（1%濃度凝膠）

三維樣品：昆蟲針定位+蠟封固定

避免使用油性膠水（易反光）

固定角度優(yōu)化

昆蟲標(biāo)本：腹面朝上+45°傾斜

電子元件：引腳朝上+標(biāo)簽標(biāo)注

植物組織：切面朝上+甘油保濕

二、擺放定位：空間層次感的營(yíng)造

景深控制技巧

多層樣品：階梯式擺放（每層間隔>5mm）

高矮樣品：泡沫塊墊高法

景深計(jì)算公式：DOF=2λ/(NA)2（λ=波長(zhǎng)，NA=數(shù)值孔徑）

背景處理

反光樣品：消光漆噴涂（啞光黑）

透明樣品：襯背染色（亞甲基藍(lán)溶液）

吸光樣品：環(huán)形LED補(bǔ)光

三、照明優(yōu)化：光影魔術(shù)的**調(diào)控

光源選擇矩陣

光路調(diào)節(jié)

暗場(chǎng)觀察：關(guān)閉透射光+側(cè)光45°入射

偏振光：添加偏振片消除反光

漫反射光：磨砂玻璃濾光片

四、圖像處理：從二維到三維的躍升

景深擴(kuò)展技術(shù)

焦點(diǎn)堆疊法：拍攝15-20張不同焦面照片

軟件推薦：Helicon Focus（自動(dòng)融合）

參數(shù)設(shè)置：重疊率70%+步進(jìn)1μm

三維合成

多角度拍攝：每30°拍攝一張（共12張）

軟件處理：Agisoft Metashape生成點(diǎn)云

輸出格式：OBJ/STL/PLY通用格式

五、特殊樣品處理技巧

液體樣品

密封艙法：使用透明比色皿

懸浮顆粒：添加甘油增加黏度

避免氣泡：真空泵脫氣處理

溫度敏感樣品

低溫臺(tái)：液氮冷卻至-196℃

加熱臺(tái)：PID溫控±0.5℃

相變觀察：緩慢升溫（0.5℃/min）

常見失敗案例警示

案例1：未固定昆蟲翅膀?qū)е掠^察時(shí)移動(dòng)
改進(jìn)方案：昆蟲針+軟蠟固定

案例2：金屬部件反光嚴(yán)重
優(yōu)化策略：環(huán)形偏振光+消光漆處理

案例3：景深不足導(dǎo)致部分結(jié)構(gòu)模糊
解決方案：焦點(diǎn)堆疊+后期融合

結(jié)語(yǔ)：讓宏觀世界躍然屏上

體視顯微鏡的樣品制備是"微觀雕塑"與"光學(xué)魔術(shù)"的結(jié)合。建議建立標(biāo)準(zhǔn)化制備流程，記錄關(guān)鍵參數(shù)（如光源角度、固定方式）。